光譜和光度特性概述
本文概述了熒光蛋白及其光譜特性。隨著 20 世紀(jì) 50 年代末熒光蛋白的發(fā)現(xiàn),熒光顯微技術(shù)發(fā)生了巨大變化。它始于 O. Shimomura 和來(lái)自水母(Aequorea victoria)的綠色熒光蛋白(GFP) [1]。后來(lái)出現(xiàn)了數(shù)百種 GFP 突變體,發(fā)出的熒光從藍(lán)色到紅色不等。來(lái)自安氏動(dòng)物(??蜕汉鳎┑臒晒獾鞍讋t將發(fā)射轉(zhuǎn)移到了遠(yuǎn)紅外[2]。蛋白質(zhì)種類(lèi)繁多,科學(xué)家們可以根據(jù)自己的需要選擇zui合適的熒光標(biāo)簽。
什么是綠色熒光蛋白(GFP)?
GFP(綠色熒光蛋白)或其變體的光譜特性取決于構(gòu)成發(fā)色團(tuán)的氨基酸結(jié)構(gòu)(圖 1)[2]。這可能是位于 65-67 位的三個(gè)氨基酸或靠近該位置的殘基(如 YFP)。除了有關(guān)發(fā)色團(tuán)的主要突變外,還進(jìn)行了其他定點(diǎn)誘變研究,以改善蛋白質(zhì)成熟和在異源細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)等其他因素(如密碼子使用、蛋白質(zhì)在生理溫度下的折疊)。請(qǐng)注意,維多利亞甲蟲(chóng)是一種相對(duì)原始的外溫海洋生物,沒(méi)有調(diào)節(jié)體溫的生理系統(tǒng)。
圖 1:GFP 的分子結(jié)構(gòu)。
盡管 GFP 因其亮度和高光穩(wěn)定性而成為zuishouhuanying的熒光粉之一,但它也有兩個(gè)主要缺點(diǎn):對(duì) pH 值有一定的敏感性和輕微的二聚傾向。二聚化或寡聚化是許多 FP 的一個(gè)問(wèn)題。它們相互凝集的傾向會(huì)產(chǎn)生假象或誤解融合蛋白的位置和功能。不過(guò),科學(xué)家們也找到了一些解決這一問(wèn)題的辦法。在關(guān)鍵位置(F223R、L221K 和 A206K)的非極性氨基酸被親水性氨基酸取代后,二聚化程度降低[3]。所有能改善光譜和實(shí)際特性的基因改變都被歸納為"增強(qiáng)型"FP。
就 wtGFP 而言,增強(qiáng)后的 EGFP(增強(qiáng)型 GFP)在 488 納米波長(zhǎng)處只有一個(gè)激發(fā)峰,而不是以前在 395 納米波長(zhǎng)和 475 納米波長(zhǎng)處的復(fù)雜吸收光譜[2,3]。Roger Heim、Douglas Prasher 和 Roger Tsien 開(kāi)發(fā)的第一種 wtGFP 突變體(S65T 突變體)的亮度是原來(lái)的五倍,而且成熟時(shí)間更短[3]。加上另一個(gè)突變體(F64L)在 37°C 溫度下的成熟效率更高,這對(duì)于觀察活細(xì)胞的人來(lái)說(shuō)具有重要作用。
藍(lán)寶石(Sapphire)[3]是一個(gè)非常有趣的 GFP 變體,它的斯托克斯位移最大??拷l(fā)色團(tuán)的一個(gè)位置發(fā)生了突變(T203I),導(dǎo)致激發(fā)最大值變?yōu)?399 納米,發(fā)射最大值變?yōu)?511 納米。這就是 112 納米的斯托克斯偏移。Emerald 是另一種 GFP 改造品,它能提高光穩(wěn)定性和亮度,并能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中更有效地折疊[3]。
所有綠色熒光蛋白都具有相對(duì)較高的亮度,而藍(lán)色熒光蛋白在顯微應(yīng)用中通常會(huì)降低發(fā)射強(qiáng)度。盡管如此,由于具有其他光譜特性,它們?nèi)员挥糜诠鈱W(xué)檢測(cè)。EBFP(增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白)是通過(guò)對(duì) wtGFP 進(jìn)行幾輪突變而構(gòu)建的[3]。第一個(gè)突變(Y66H)使發(fā)射峰從綠色變?yōu)樗{(lán)色。隨后更多的突變產(chǎn)生了一種激發(fā)最大波長(zhǎng)為 380 納米、發(fā)射最大波長(zhǎng)為 448 納米的蛋白質(zhì)。這些光譜特性使其成為 EGFP 在 FRET 顯微鏡下的搭檔。最近,Azurite,SBFP2和 EBFP2 等藍(lán)色熒光蛋白具有更高的量子產(chǎn)率和更好的光穩(wěn)定性[3]。EBFP 的后繼者是一種名為 Sirius 的蛋白質(zhì),這種蛋白質(zhì)對(duì) pH 值的耐受性非常高(在 pH 值 3 到 9 之間都很穩(wěn)定),而且是迄今為止發(fā)射波長(zhǎng)最短的熒光蛋白,因此很受歡迎[3]。
第二類(lèi) "藍(lán)色" GFP 變體是由青色熒光蛋白 (CFPs)形成的[3]。用色氨酸取代酪氨酸(Y66W)并進(jìn)一步改變基因,可產(chǎn)生亮度和光穩(wěn)定性更好的熒光色素。這種 ECFP 在 433/445 納米和 475/503 納米具有雙峰激發(fā)和發(fā)射光譜。亮度僅為 EGFP 的 40%。Cerulean 是 ECFP 的一個(gè)重要變體,它具有更高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率 [3]。它的亮度是 ECFP 的 1.5 倍,被用作 YFP 的 FRET 伴侶。
GFP 的突變并不直接改變發(fā)色團(tuán)三個(gè)中心氨基酸中的一個(gè),因此出現(xiàn)了黃色熒光蛋白(YFP)[3]。YFP 在 203 位有一個(gè)共同的蘇氨酸,該位置被一個(gè)酪氨酸(T203Y)取代。該氨基酸是 β 管的一部分,靠近發(fā)色團(tuán)。與 GFP 相比,EYFP 的激發(fā)和發(fā)射特性已轉(zhuǎn)向更長(zhǎng)的波長(zhǎng),其激發(fā)和發(fā)射最大值分別為 514 納米和 527 納米(EYFP)。EYFP 的一個(gè)特點(diǎn)是對(duì) pH 值敏感。在 pH 值為 6.5 時(shí),EYFP 只有約 50%的熒光,但這并不總是一個(gè)缺點(diǎn)。在測(cè)量 pH 值(如囊泡、內(nèi)體等)時(shí),EYFP 可用作指示劑。有趣的是,進(jìn)一步的突變(Q69M)產(chǎn)生了更好的酸穩(wěn)定性并顯著提高了亮度(比 EGFP 亮 75%)。與 EGFP 相比,這種蛋白質(zhì)的光穩(wěn)定性仍然較差,因此被稱(chēng)為Citrine [3]。另一種 YFP 突變體(F46L)的成熟速度大大加快,耐酸堿性也有所提高。這種蛋白質(zhì)被命名為 Venus,是 Cerulean 的一種常見(jiàn) FRET 受體 [3]。
來(lái)自類(lèi)動(dòng)物的熒光蛋白質(zhì)
如上圖所示,來(lái)自維多利亞水母的大多數(shù)熒光蛋白發(fā)出的光譜為藍(lán)色至黃色。紅色熒光蛋白則不見(jiàn)蹤影。俄羅斯科學(xué)家謝爾蓋-盧基揚(yáng)諾夫(Sergey Lukyanov)發(fā)現(xiàn)了擬水螅中的熒光蛋白,tianbu了這一空白[4]。與其他熒光蛋白相比,紅色熒光蛋白(RFPs)具有很大的優(yōu)勢(shì),因?yàn)樵诠庾V的紅色部分,細(xì)胞中的自發(fā)熒光要少得多[3]。此外,它們能被較長(zhǎng)的波長(zhǎng)激發(fā),這對(duì)活細(xì)胞更有利,因?yàn)檩^短波長(zhǎng)的光對(duì)標(biāo)本的損害更大。與水母蛋白相比,珊瑚蛋白的另一個(gè)普遍優(yōu)勢(shì)是它們能在 37°C 溫度下高效成熟。維多利亞A. GFP及其衍生物必須經(jīng)過(guò)基因改造才能以正確的方式折疊,而動(dòng)物蛋白的成熟則無(wú)需分子工程。這可能是由于其生物群落的水溫較高。
在擬水生動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一種 FPs,也是目前使用最多的 FPs 之一是 DsRed[3]。其名稱(chēng)來(lái)源于???Discosoma striata。DsRed 的激發(fā)最大波長(zhǎng)為 558 nm,發(fā)射峰值為 583 nm。然而,當(dāng)其結(jié)構(gòu)信息公布后,最初的興奮就停滯不前了。DsRed 的成熟速度比水母 FP 慢得多,并且有一個(gè)中間發(fā)色團(tuán)階段。這一階段發(fā)出的光為綠色光譜,會(huì)與其他 FP 重疊。GFP 部分已經(jīng)提到,DsRed 還有另一個(gè)問(wèn)題。??t色熒光蛋白是一種強(qiáng)制性四聚體,容易形成寡聚體。這可能導(dǎo)致對(duì)融合蛋白的位置和功能產(chǎn)生誤解。一般來(lái)說(shuō),安氏無(wú)脊椎動(dòng)物的 FPs 與維多利亞無(wú)脊椎動(dòng)物的 FPs 具有相似的結(jié)構(gòu)。發(fā)色團(tuán)隱藏在大小為 4 nm x 3 nm(高 x 直徑)的 β 管狀結(jié)構(gòu)中。不同之處在于安氏囊蟲(chóng)的 β-桶狀結(jié)構(gòu)更像橢圓形(圖 2)。
在 GFP "進(jìn)化" 的同時(shí),研究人員開(kāi)始對(duì)原始 DsRed 進(jìn)行改造,以克服其結(jié)構(gòu)缺陷。第二代 DsRed--DsRed2--減少了寡聚體的形成趨勢(shì),加快了成熟速度,最大限度地減少了綠色發(fā)光的中間階段[3]。進(jìn)一步的誘變導(dǎo)致紅色 FP wanquan失去了四聚體狀態(tài),但也喪失了部分量子產(chǎn)率(DsRed2 的 25%)。錢(qián)氏實(shí)驗(yàn)室的這項(xiàng)工作產(chǎn)生了第一個(gè)單體紅色熒光蛋白,因此他們稱(chēng)之為 mRFP1 [3]。
隨后,以這種 mRFP1 為起點(diǎn),產(chǎn)生了一組六種單體 FP,統(tǒng)稱(chēng)為 "mFruit" [3]。它們各自的名稱(chēng)源自其發(fā)射顏色:mHoneydew、mBanana、mOrange、mTangerine、mStrawberry 和 mCherry。mCherry 是這些 FPs 中最有用的一種,它在 610 納米范圍內(nèi)發(fā)光,亮度是 EGFP 的 50%。
迄今為止最耀眼的 FP 是 mFruit 派系的追隨者,名為 tdTomato [3]。在基因改變之前,dTomato 是一種強(qiáng)制性二聚體,但通過(guò)將兩個(gè)二聚化伙伴放在一個(gè)分子中,避免了二聚化。兩個(gè) dTomato 單元通過(guò) 12 個(gè)氨基酸連接體耦合,形成串聯(lián)二聚體 FP tdTomato,其發(fā)射最大值為 581 納米,在光譜的最高區(qū)域具有光穩(wěn)定性。
mPlum是所有 mFruit 蛋白中紅色發(fā)射最深的一種,發(fā)射波長(zhǎng)為 649 nm [3]。
圖 2:DsRed 熒光蛋白的分子結(jié)構(gòu)。
科學(xué)上使用的綠色熒光類(lèi)動(dòng)物蛋白數(shù)量非常少,這并不令人驚訝,因?yàn)槲覀円呀?jīng)有了zhongsuozhouzhi,使用方便的維多利亞蟲(chóng) GFP。顯然,沒(méi)有人認(rèn)為有必要建立一種新的綠色熒光蛋白。盡管如此,還是有一些新的綠色熒光蛋白出現(xiàn)了,比如石珊瑚中的一種明亮熒光蛋白--Azami Green [3]。有趣的是,它與 EGFP 的序列同源性不到 6%。
Katushka 是一種對(duì)深部組織成像具有重大影響的擬態(tài)熒光蛋白 [3]。通過(guò)對(duì)來(lái)自 E. quadricolor 的 RFPs 進(jìn)行誘變,發(fā)現(xiàn) Katushka 是一種二聚體蛋白,在 635 納米波長(zhǎng)處具有最大發(fā)射亮度,是所有深紅色熒光蛋白中亮度zuigao的。Katushka的單體形式被稱(chēng)為 mKate,后來(lái)被提供了更高亮度的 mKate2 [3]。
總之,今天用于顯微應(yīng)用的所有熒光蛋白都來(lái)自原始海洋生物。表 1 列出了最重要的熒光蛋白及其相關(guān)光譜特性,如激發(fā)和發(fā)射最大值、光穩(wěn)定性、量子產(chǎn)率和亮度。
展 望
一個(gè)非常有趣的故事是,人們發(fā)現(xiàn)了一種由脊椎動(dòng)物表達(dá)的 FP。文昌魚(yú)(Amphioxus)是一種小型魚(yú)類(lèi)海洋脊索動(dòng)物,在其前端產(chǎn)生AmphiGFP [3]。對(duì)該 FP 的序列分析表明,它具有典型的 β-桶狀結(jié)構(gòu),似乎與橈足類(lèi) Pontellina plumata(甲殼動(dòng)物)的 CopGFP有關(guān) [5]。這一發(fā)現(xiàn)表明,熒光現(xiàn)象并不局限于原始無(wú)脊椎動(dòng)物,在更高進(jìn)化階段的動(dòng)物中也能發(fā)現(xiàn)。此外,這一發(fā)現(xiàn)還表明,熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)、改造和增強(qiáng)過(guò)程仍在繼續(xù),這也是目前的熱門(mén)研究課題。這一事實(shí)證明了熒光蛋白對(duì)當(dāng)前和未來(lái)生命科學(xué)研究的重要性和巨大影響。
熒光蛋白質(zhì)的光譜特性
Ex:峰值激發(fā)波長(zhǎng)(納米)
Em:峰值發(fā)射波長(zhǎng)(納米)
MW:分子量 QY:量子產(chǎn)率
BR:亮度;
消光系數(shù) * 量子產(chǎn)率/1,000
PS:光穩(wěn)定性;亮度達(dá)到 50%的時(shí)間(秒)
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表 1:熒光蛋白的光譜特性 (數(shù)據(jù)來(lái)源為參與文獻(xiàn) 6)。
相關(guān)產(chǎn)品
DMi 8gaoduan倒置顯微鏡平臺(tái)
STELLARIS 5 & STELLARIS 8 共聚焦顯微鏡平臺(tái)
MICA全場(chǎng)景顯微成像分析平臺(tái)
參考文獻(xiàn):(上下滑動(dòng)查看更多)
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