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熒光蛋白簡(jiǎn)介

更新時(shí)間:2024-03-01      點(diǎn)擊次數(shù):746

光譜和光度特性概述


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本文概述了熒光蛋白及其光譜特性。隨著 20 世紀(jì) 50 年代末熒光蛋白的發(fā)現(xiàn),熒光顯微技術(shù)發(fā)生了巨大變化。它始于 O. Shimomura 和來(lái)自水母(Aequorea victoria)的綠色熒光蛋白(GFP) [1]。后來(lái)出現(xiàn)了數(shù)百種 GFP 突變體,發(fā)出的熒光從藍(lán)色到紅色不等。來(lái)自安氏動(dòng)物(??蜕汉鳎┑臒晒獾鞍讋t將發(fā)射轉(zhuǎn)移到了遠(yuǎn)紅外[2]蛋白質(zhì)種類(lèi)繁多,科學(xué)家們可以根據(jù)自己的需要選擇zui合適的熒光標(biāo)簽。



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來(lái)自 A. 維多利亞州的熒光蛋白

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什么是綠色熒光蛋白(GFP)?


GFP(綠色熒光蛋白)或其變體的光譜特性取決于構(gòu)成發(fā)色團(tuán)的氨基酸結(jié)構(gòu)(圖 1)[2]。這可能是位于 65-67 位的三個(gè)氨基酸或靠近該位置的殘基(如 YFP)。除了有關(guān)發(fā)色團(tuán)的主要突變外,還進(jìn)行了其他定點(diǎn)誘變研究,以改善蛋白質(zhì)成熟和在異源細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)等其他因素(如密碼子使用、蛋白質(zhì)在生理溫度下的折疊)。請(qǐng)注意,維多利亞甲蟲(chóng)是一種相對(duì)原始的外溫海洋生物,沒(méi)有調(diào)節(jié)體溫的生理系統(tǒng)。

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圖 1:GFP 的分子結(jié)構(gòu)。

盡管 GFP 因其亮度和高光穩(wěn)定性而成為zuishouhuanying的熒光粉之一,但它也有兩個(gè)主要缺點(diǎn):對(duì) pH 值有一定的敏感性和輕微的二聚傾向。二聚化或寡聚化是許多 FP 的一個(gè)問(wèn)題。它們相互凝集的傾向會(huì)產(chǎn)生假象或誤解融合蛋白的位置和功能。不過(guò),科學(xué)家們也找到了一些解決這一問(wèn)題的辦法。在關(guān)鍵位置(F223R、L221K 和 A206K)的非極性氨基酸被親水性氨基酸取代后,二聚化程度降低[3]。所有能改善光譜和實(shí)際特性的基因改變都被歸納為"增強(qiáng)型"FP。


就 wtGFP 而言,增強(qiáng)后的 EGFP(增強(qiáng)型 GFP)在 488 納米波長(zhǎng)處只有一個(gè)激發(fā)峰,而不是以前在 395 納米波長(zhǎng)和 475 納米波長(zhǎng)處的復(fù)雜吸收光譜[2,3]。Roger Heim、Douglas Prasher 和 Roger Tsien 開(kāi)發(fā)的第一種 wtGFP 突變體(S65T 突變體)的亮度是原來(lái)的五倍,而且成熟時(shí)間更短[3]。加上另一個(gè)突變體(F64L)在 37°C 溫度下的成熟效率更高,這對(duì)于觀察活細(xì)胞的人來(lái)說(shuō)具有重要作用。


藍(lán)寶石(Sapphire)[3]是一個(gè)非常有趣的 GFP 變體,它的斯托克斯位移最大??拷l(fā)色團(tuán)的一個(gè)位置發(fā)生了突變(T203I),導(dǎo)致激發(fā)最大值變?yōu)?399 納米,發(fā)射最大值變?yōu)?511 納米。這就是 112 納米的斯托克斯偏移。Emerald 是另一種  GFP 改造品,它能提高光穩(wěn)定性和亮度,并能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中更有效地折疊[3]。


所有綠色熒光蛋白都具有相對(duì)較高的亮度,而藍(lán)色熒光蛋白在顯微應(yīng)用中通常會(huì)降低發(fā)射強(qiáng)度。盡管如此,由于具有其他光譜特性,它們?nèi)员挥糜诠鈱W(xué)檢測(cè)。EBFP(增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白)是通過(guò)對(duì) wtGFP 進(jìn)行幾輪突變而構(gòu)建的[3]。第一個(gè)突變(Y66H)使發(fā)射峰從綠色變?yōu)樗{(lán)色。隨后更多的突變產(chǎn)生了一種激發(fā)最大波長(zhǎng)為 380 納米、發(fā)射最大波長(zhǎng)為 448 納米的蛋白質(zhì)。這些光譜特性使其成為 EGFP 在 FRET 顯微鏡下的搭檔。最近,Azurite,SBFP2和 EBFP2 等藍(lán)色熒光蛋白具有更高的量子產(chǎn)率和更好的光穩(wěn)定性[3]。EBFP 的后繼者是一種名為 Sirius 的蛋白質(zhì),這種蛋白質(zhì)對(duì) pH 值的耐受性非常高(在 pH 值 3 到 9 之間都很穩(wěn)定),而且是迄今為止發(fā)射波長(zhǎng)最短的熒光蛋白,因此很受歡迎[3]。


第二類(lèi) "藍(lán)色" GFP 變體是由青色熒光蛋白 (CFPs)形成的[3]。用色氨酸取代酪氨酸(Y66W)并進(jìn)一步改變基因,可產(chǎn)生亮度和光穩(wěn)定性更好的熒光色素。這種 ECFP 在 433/445 納米和 475/503 納米具有雙峰激發(fā)和發(fā)射光譜。亮度僅為 EGFP 的 40%。Cerulean 是 ECFP 的一個(gè)重要變體,它具有更高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率 [3]。它的亮度是 ECFP 的 1.5 倍,被用作 YFP 的 FRET 伴侶。


GFP 的突變并不直接改變發(fā)色團(tuán)三個(gè)中心氨基酸中的一個(gè),因此出現(xiàn)了黃色熒光蛋白(YFP)[3]。YFP 在 203 位有一個(gè)共同的蘇氨酸,該位置被一個(gè)酪氨酸(T203Y)取代。該氨基酸是 β 管的一部分,靠近發(fā)色團(tuán)。與 GFP 相比,EYFP 的激發(fā)和發(fā)射特性已轉(zhuǎn)向更長(zhǎng)的波長(zhǎng),其激發(fā)和發(fā)射最大值分別為 514 納米和 527 納米(EYFP)。EYFP 的一個(gè)特點(diǎn)是對(duì) pH 值敏感。在 pH 值為 6.5 時(shí),EYFP 只有約 50%的熒光,但這并不總是一個(gè)缺點(diǎn)。在測(cè)量 pH 值(如囊泡、內(nèi)體等)時(shí),EYFP 可用作指示劑。有趣的是,進(jìn)一步的突變(Q69M)產(chǎn)生了更好的酸穩(wěn)定性并顯著提高了亮度(比 EGFP 亮 75%)。與 EGFP 相比,這種蛋白質(zhì)的光穩(wěn)定性仍然較差,因此被稱(chēng)為Citrine [3]。另一種 YFP 突變體(F46L)的成熟速度大大加快,耐酸堿性也有所提高。這種蛋白質(zhì)被命名為 Venus,是 Cerulean 的一種常見(jiàn) FRET 受體 [3]。





來(lái)自類(lèi)動(dòng)物的熒光蛋白質(zhì)


如上圖所示,來(lái)自維多利亞水母的大多數(shù)熒光蛋白發(fā)出的光譜為藍(lán)色至黃色。紅色熒光蛋白則不見(jiàn)蹤影。俄羅斯科學(xué)家謝爾蓋-盧基揚(yáng)諾夫(Sergey Lukyanov)發(fā)現(xiàn)了擬水螅中的熒光蛋白,tianbu了這一空白[4]。與其他熒光蛋白相比,紅色熒光蛋白(RFPs)具有很大的優(yōu)勢(shì),因?yàn)樵诠庾V的紅色部分,細(xì)胞中的自發(fā)熒光要少得多[3]。此外,它們能被較長(zhǎng)的波長(zhǎng)激發(fā),這對(duì)活細(xì)胞更有利,因?yàn)檩^短波長(zhǎng)的光對(duì)標(biāo)本的損害更大。與水母蛋白相比,珊瑚蛋白的另一個(gè)普遍優(yōu)勢(shì)是它們能在 37°C 溫度下高效成熟。維多利亞A. GFP及其衍生物必須經(jīng)過(guò)基因改造才能以正確的方式折疊,而動(dòng)物蛋白的成熟則無(wú)需分子工程。這可能是由于其生物群落的水溫較高。


在擬水生動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一種 FPs,也是目前使用最多的 FPs 之一是 DsRed[3]。其名稱(chēng)來(lái)源于???Discosoma striata。DsRed 的激發(fā)最大波長(zhǎng)為 558 nm,發(fā)射峰值為 583 nm。然而,當(dāng)其結(jié)構(gòu)信息公布后,最初的興奮就停滯不前了。DsRed 的成熟速度比水母 FP 慢得多,并且有一個(gè)中間發(fā)色團(tuán)階段。這一階段發(fā)出的光為綠色光譜,會(huì)與其他 FP 重疊。GFP 部分已經(jīng)提到,DsRed 還有另一個(gè)問(wèn)題。??t色熒光蛋白是一種強(qiáng)制性四聚體,容易形成寡聚體。這可能導(dǎo)致對(duì)融合蛋白的位置和功能產(chǎn)生誤解。一般來(lái)說(shuō),安氏無(wú)脊椎動(dòng)物的 FPs 與維多利亞無(wú)脊椎動(dòng)物的 FPs 具有相似的結(jié)構(gòu)。發(fā)色團(tuán)隱藏在大小為 4 nm x 3 nm(高 x 直徑)的 β 管狀結(jié)構(gòu)中。不同之處在于安氏囊蟲(chóng)的 β-桶狀結(jié)構(gòu)更像橢圓形(圖 2)。


在 GFP "進(jìn)化" 的同時(shí),研究人員開(kāi)始對(duì)原始 DsRed 進(jìn)行改造,以克服其結(jié)構(gòu)缺陷。第二代 DsRed--DsRed2--減少了寡聚體的形成趨勢(shì),加快了成熟速度,最大限度地減少了綠色發(fā)光的中間階段[3]。進(jìn)一步的誘變導(dǎo)致紅色 FP wanquan失去了四聚體狀態(tài),但也喪失了部分量子產(chǎn)率(DsRed2 的 25%)。錢(qián)氏實(shí)驗(yàn)室的這項(xiàng)工作產(chǎn)生了第一個(gè)單體紅色熒光蛋白,因此他們稱(chēng)之為 mRFP1 [3]。


隨后,以這種 mRFP1 為起點(diǎn),產(chǎn)生了一組六種單體 FP,統(tǒng)稱(chēng)為 "mFruit" [3]。它們各自的名稱(chēng)源自其發(fā)射顏色:mHoneydew、mBanana、mOrange、mTangerine、mStrawberry 和 mCherry。mCherry 是這些 FPs 中最有用的一種,它在 610 納米范圍內(nèi)發(fā)光,亮度是 EGFP 的 50%。


迄今為止最耀眼的 FP 是 mFruit 派系的追隨者,名為 tdTomato [3]。在基因改變之前,dTomato 是一種強(qiáng)制性二聚體,但通過(guò)將兩個(gè)二聚化伙伴放在一個(gè)分子中,避免了二聚化。兩個(gè) dTomato 單元通過(guò) 12 個(gè)氨基酸連接體耦合,形成串聯(lián)二聚體 FP tdTomato,其發(fā)射最大值為 581 納米,在光譜的最高區(qū)域具有光穩(wěn)定性。


mPlum是所有 mFruit 蛋白中紅色發(fā)射最深的一種,發(fā)射波長(zhǎng)為 649 nm [3]

3.jpg

圖 2:DsRed 熒光蛋白的分子結(jié)構(gòu)。

科學(xué)上使用的綠色熒光類(lèi)動(dòng)物蛋白數(shù)量非常少,這并不令人驚訝,因?yàn)槲覀円呀?jīng)有了zhongsuozhouzhi,使用方便的維多利亞蟲(chóng) GFP。顯然,沒(méi)有人認(rèn)為有必要建立一種新的綠色熒光蛋白。盡管如此,還是有一些新的綠色熒光蛋白出現(xiàn)了,比如石珊瑚中的一種明亮熒光蛋白--Azami Green [3]。有趣的是,它與 EGFP 的序列同源性不到 6%。


Katushka 是一種對(duì)深部組織成像具有重大影響的擬態(tài)熒光蛋白 [3]。通過(guò)對(duì)來(lái)自 E. quadricolor 的 RFPs 進(jìn)行誘變,發(fā)現(xiàn) Katushka 是一種二聚體蛋白,在 635 納米波長(zhǎng)處具有最大發(fā)射亮度,是所有深紅色熒光蛋白中亮度zuigao的。Katushka的單體形式被稱(chēng)為 mKate,后來(lái)被提供了更高亮度的 mKate2 [3]。


總之,今天用于顯微應(yīng)用的所有熒光蛋白都來(lái)自原始海洋生物。表 1 列出了最重要的熒光蛋白及其相關(guān)光譜特性,如激發(fā)和發(fā)射最大值、光穩(wěn)定性、量子產(chǎn)率和亮度。



展 望

一個(gè)非常有趣的故事是,人們發(fā)現(xiàn)了一種由脊椎動(dòng)物表達(dá)的 FP。文昌魚(yú)(Amphioxus)是一種小型魚(yú)類(lèi)海洋脊索動(dòng)物,在其前端產(chǎn)生AmphiGFP [3]。對(duì)該 FP 的序列分析表明,它具有典型的 β-桶狀結(jié)構(gòu),似乎與橈足類(lèi) Pontellina plumata(甲殼動(dòng)物)的 CopGFP有關(guān) [5]。這一發(fā)現(xiàn)表明,熒光現(xiàn)象并不局限于原始無(wú)脊椎動(dòng)物,在更高進(jìn)化階段的動(dòng)物中也能發(fā)現(xiàn)。此外,這一發(fā)現(xiàn)還表明,熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)、改造和增強(qiáng)過(guò)程仍在繼續(xù),這也是目前的熱門(mén)研究課題。這一事實(shí)證明了熒光蛋白對(duì)當(dāng)前和未來(lái)生命科學(xué)研究的重要性和巨大影響。




熒光蛋白質(zhì)的光譜特性



Ex:峰值激發(fā)波長(zhǎng)(納米)


Em:峰值發(fā)射波長(zhǎng)(納米)


MW:分子量 QY:量子產(chǎn)率


BR:亮度;


消光系數(shù) * 量子產(chǎn)率/1,000


PS:光穩(wěn)定性;亮度達(dá)到 50%的時(shí)間(秒)

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圖片

表 1:熒光蛋白的光譜特性 (數(shù)據(jù)來(lái)源為參與文獻(xiàn) 6)。

相關(guān)產(chǎn)品

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DMi 8gaoduan倒置顯微鏡平臺(tái)


6.png

STELLARIS 5 & STELLARIS 8 共聚焦顯微鏡平臺(tái)



7.png


MICA全場(chǎng)景顯微成像分析平臺(tái)




參考文獻(xiàn):(上下滑動(dòng)查看更多)

1.O. Shimomura, Discovery of Green Fluorescent Protein, GFP, Nobel Lecture, Nobel Prize in Chemistry 2008 (Nobel Foundation, December 8, 2008).

2.G.-J. Kremers, S.G. Gilbert, P.J. Cranfill, M.W. Davidson, D.W. Piston, Fluorescent proteins at a glance, J. Cell Sci. (2011) vol. 124, iss. 2, pp. 157-160, DOI: 10.1242/jcs.072744.

3.R.N. Day, M.W. Davidson, The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging, Chem. Soc. Rev. (2009) vo. 38, iss. 10, pp. 2887-2921, DOI: 10.1039/b901966a.

4.C. Greb, Fluorescent Proteins - From the Beginnings to the Nobel Prize, Science Lab (2012) Leica Microsystems.

5.D. A. Shagin, E.V. Barsova, Y.G. Yanushevich, A.F. Fradkov, K.A. Lukyanov, Y.A. Labas, T.N. Semenova, J.A. Ugalde, A. Meyers, J.M. Nunez, E.A. Widder, S.A. Lukyanov, M.V. Matz, GFP-like Proteins as Ubiquitous Metazoan Superfamily: Evolution of Functional Features and Structural Complexity, Molecular Biology and Evolution (2004) vol. 21, iss. 5, pp. 841-850, DOI: 10.1093/molbev/msh079.

6.Fluorescent Proteins, Table of Fluorochromes, Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, California, USA.

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